蛋白純化是指通過基因工程技術將編碼蛋白的核酸序列導入到宿主細胞，使其大量表達，再使用適當的純化方法將其在體外純化出來，從而獲得高純度、活性和產量的蛋白質。蛋白質表達系統可以分為原核表達系統和真核表達系統兩大類，我們今天主要來看下原核表達系統！

乳糖操縱子的神奇開關：

原核系統的核心秘密藏在lac操縱子！平時阻遏蛋白鎖死基因表達，但加入IPTG后秒變超級開關——這個穩定耐造的誘導劑能騙過細菌，24小時持續激活蛋白表達，產量直接拉滿！

Figure 1  乳糖操縱子和IPTG原理示意圖

宿主菌株怎么選？

BL21：新手友好型！適合普通非毒性蛋白，具有大腸桿菌聚合酶，故可適用于tac或trc等使用大腸桿菌RNA聚合酶的原核系統的表達（如：pGEX，pMAL質粒）。

BL21(DE3)：雙引擎驅動！在BL21菌株的染色體上整合了λ噬菌體DE3區的T7噬菌體RNA聚合酶基因，加上大腸桿菌RNA聚合酶，適配pET系列，pGEX，pMAL等高端質粒。

重要Tip：DE3菌株遇到毒性蛋白會自我毀滅，記得改用特殊菌株如：BL21 AI、BL21 (DE3) pLysS、BL21 (DE3) pLysE、Lemo21(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)和M15 pREP4。

蛋白純化四部曲：

1. 基因改造：His標簽/NusA融合，給蛋白裝上GPS！PCR擴增目的基因，雙酶切基因片段與載體后連接，轉化至DH5α感受態，挑取單菌落培養，提取質粒并進行測序驗證，將陽性重組質粒熱激轉化至BL21(DE3)，涂布含抗生素LB平板，37℃過夜培養

2. 誘導表達：挑取單克隆接種于3 mL LB培養基，37℃振蕩培養12-16 h。按1:1000比例轉接至新鮮培養基，37℃培養至OD600達0.6-0.8時，設置梯度誘導體系：分別考察IPTG濃度（0.1-1.0 mM）與誘導溫度（16℃、30℃、37℃）的協同效應，其中低溫誘導時間延長至16-20 h（16℃）或6-8 h（30℃）。通過SDS-PAGE分析誘導前后菌體蛋白表達差異，篩選可溶性表達最佳條件。

3. 大規模蛋白誘導與菌體收集：采用優化條件進行2 L規模發酵。菌體離心（4000 g，4℃，15 min）后按1:10 (w/v)比例加入預冷的裂解緩沖液（含1% Triton X-100，20 mM咪唑及蛋白酶抑制劑），冰浴30 min。高壓均質儀于800 kPa壓力下循環破碎3-5次，直至菌液透明度顯著增加。離心收集上清（12000 g，4℃，20 min），分離可溶性與包涵體組分。

4. 親和層析：使用Ni-NTA樹脂進行金屬螯合層析。首先用5倍柱體積裂解緩沖液平衡層析柱，將含有His標簽蛋白的裂解上清與樹脂4℃結合2 h。依次用含40 mM、60 mM咪唑的洗滌緩沖液去除雜蛋白，最后用250 mM咪唑洗脫緩沖液分步洗脫目的蛋白。全程收集各階段流出液進行SDS-PAGE監控。

Figure 2  原核表達系統純化蛋白全流程

為什么選His標簽？

組氨酸標記（His-tag）是最常用的標簽之一，通過在蛋白N端或C端添加6-10個組氨酸殘基，使其能夠特異性結合Ni²⁺螯合介質。該結合作用在非變性或變性條件（如8M尿素）下均穩定存在，最終通過咪唑溶液競爭性置換結合His-tag的Ni²+，實現目標蛋白的特異性洗脫與純化。

關鍵優化策略
（1）采用低溫誘導（16℃）結合低濃度IPTG（0.2 mM）有效提升可溶蛋白比例

（2）在裂解緩沖液中添加0.5 M精氨酸顯著減少非特異性吸附

（3）梯度咪唑洗滌（20-60 mM）使純度提高約35%。

原核表達雖“快準狠”，但復雜蛋白（如含二硫鍵、翻譯后修飾）建議轉向真核系統哦！

普健生物（AtaGenix）專注于蛋白抗體開發，其核心優勢之一是成熟高效的五大蛋白表達系統，覆蓋原核與真核體系，可滿足不同蛋白的表達需求。大腸桿菌原核表達系統有表達量高，成本低，周期短，發酵工藝成熟等優勢，真核表達系統包含哺乳動物細胞（支持復雜翻譯后修飾，適合抗體藥物、Fc 融合蛋白）、昆蟲細胞（超大分子兼容性，如跨膜蛋白和病毒樣顆粒）、酵母（高密度發酵，中等復雜度蛋白）及植物細胞（安全性高、規模化生產治療蛋白），滿足從基礎研究到藥物開發的多樣化需求。