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肝細(xì)胞癌（HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，晚期患者5年生存率低于20%，現(xiàn)有治療如手術(shù)切除和靶向藥物雖可緩解，但復(fù)發(fā)率高且耐藥性問題突出，仍需開發(fā)增強腫瘤特異性T細(xì)胞浸潤的免疫療法；個性化neoantigen mRNA疫苗通過靶向腫瘤突變衍生抗原，有望激活強效免疫應(yīng)答，而mRNA遞送系統(tǒng)的肝臟優(yōu)先分布可能導(dǎo)致肝損傷，因此設(shè)計脾靶向脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）以提升療效和安全性成為關(guān)鍵研究方向。
Figure 1. L242-20Lipo在體內(nèi)遞送個性化新抗原mRNA
篩選和優(yōu)化用于脾臟靶向mRNA遞送的LNPS
研究初期通過合成離子化脂質(zhì)庫，篩選出25種候選物，配制含18:1 PA的LNPs，體內(nèi)遞送GFP mRNA顯示L221和L242轉(zhuǎn)染效率最高。進一步優(yōu)化L242-20Lipo摩爾比，體內(nèi)熒光素酶mRNA遞送實驗表明其脾臟蓄積顯著，肝臟分布最小，脾肝信號比較對照高4.5倍，理化表征證實表面電荷調(diào)控提升了脾選擇性（Fig.2E-H）。此發(fā)現(xiàn)為后續(xù)免疫靶向奠定了基礎(chǔ)。
Figure 2. 脾臟靶向脂質(zhì)納米顆粒的篩選
脾臟靶向脂質(zhì)納米顆粒(LNPS)對樹突狀細(xì)胞(DCs)的影響
為評估脾靶向LNPs對樹突狀細(xì)胞（DCs）的效應(yīng)，研究在Ai14報告小鼠中遞送編碼Cre重組酶的mRNA，通過tdTomato表達追蹤轉(zhuǎn)染細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示，Cre-L242-20Lipo在DCs中的攝取率達27%，較對照L0315-20Lipo高3.4倍，且劑量依賴性GFP mRNA遞送進一步證實其DCs靶向優(yōu)勢。隨后，遞送neoantigen mRNA（Hepa-M01-mRNA）后，DCs中CD40和CD86表達分別提升7.5倍和5.7倍，ELISA檢測顯示IL-12和TNF-α分泌顯著增加。這一系列結(jié)果表明，L242-20Lipo高效促進DCs的抗原攝取和激活，為neoantigen疫苗誘導(dǎo)強效免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。
Figure 3. mRNA展示中關(guān)鍵細(xì)胞的探索
B16M01-mL242在B16F10腫瘤模型中的驗證
在B16F10黑色素瘤模型中，研究團隊通過B16M01-mL242疫苗以0.5 mg/kg劑量進行三次接種，成功激發(fā)了脾臟和淋巴結(jié)中的T細(xì)胞激活。這一策略顯著增強了免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出腫瘤體積和重量的顯著減小，同時顯著延長了小鼠的生存期。通過深入分析，研究發(fā)現(xiàn)疫苗接種后腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TILs）中的CD8+ T細(xì)胞表現(xiàn)出強勁的IFN-γ分泌能力，表明該疫苗在誘導(dǎo)針對黑色素瘤的抗腫瘤免疫反應(yīng)方面效果顯著。
Figure 4. T細(xì)胞反應(yīng)和B16M01-mL242的抗腫瘤療效
NeoPol-mL242在原位肝細(xì)胞癌模型中的抗腫瘤免疫作用
為了在原位HCC模型中評估NeoPol-mL242的抗腫瘤免疫，研究團隊將NeoPol設(shè)計為包含Hepa-M01至M07的七個neoantigens，小鼠接受三次疫苗接種，通過體內(nèi)成像系統(tǒng)監(jiān)測腫瘤進展，結(jié)果顯示NeoPol-mL242組腫瘤負(fù)擔(dān)較對照組降低約90%，0.5 mg/kg組展現(xiàn)顯著生存延長和體重穩(wěn)定；進一步檢測發(fā)現(xiàn)疫苗治療組腫瘤中CD8+ T細(xì)胞浸潤水平更高，Ki67和TUNEL測定顯示腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著下降、凋亡率升高，這些發(fā)現(xiàn)表明NeoPol-mL242有效激活抗腫瘤免疫，抑制HCC生長。
Figure 5. NeoPol-mL242疫苗的免疫特異性
NeoPol-mL242疫苗的免疫特異性
基于上述結(jié)果，研究進一步評估NeoPol-mL242疫苗的免疫特異性，通過肽-MHC tetramer染色分析neoantigen特異性CD8+ TILs和中心記憶CD8+ T細(xì)胞（TCMs，CD44+ CD62L+），結(jié)果顯示疫苗組腫瘤內(nèi)neoantigen特異性CD8+ T細(xì)胞比例更高、CD8+ TCMs顯著增加，其中Anti-mouse MHC-Tetramer-PE (Ptpn2376-384(RWLYWQPTL): H-2Kb)由普健生物提供，為驗證特異性，研究人員用七個neoantigenic peptides或野生型peptides刺激BMDCs，然后與疫苗組小鼠脾T細(xì)胞共培養(yǎng)，ex vivo IFN-γ ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)顯示NeoPol-mL242組T細(xì)胞激活明顯，CD69+和IFN-γ+ T細(xì)胞頻率統(tǒng)計顯著增加、斑點形成細(xì)胞呈劑量依賴性升高3.8倍、CD69+ NK細(xì)胞比例達10.8%，野生型對照無效；此外，從疫苗組分離的CD8+ T細(xì)胞與Hepa1-6細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)約42%靶細(xì)胞凋亡，TNF-α分泌顯著升高（對應(yīng)Fig. 6L-N），這些數(shù)據(jù)證實NeoPol-mL242通過DCs依賴途徑誘導(dǎo)neoantigen特異性T細(xì)胞免疫，增強腫瘤殺傷能力。
Figure 6. BMDCS與來自免疫小鼠的脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)的示意圖
NeoPol-mL242疫苗在小鼠中的安全性評估
在小鼠中進行NeoPol-mL242疫苗的安全性評估，通過血清生化和組織病理學(xué)分析，觀察到肝酶AST和ALT短暫升高，于24 h峰值后72 h內(nèi)恢復(fù)正常，無ALP、ALB或TP水平顯著差異；ELISA量化血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IP-10顯示接種后2 h短暫升高，一周內(nèi)恢復(fù)基線；主要器官（肝、心、脾、肺、腎）組織病理學(xué)無病理改變，注射后6個月無組織損傷；GFP mRNA-L242-20Lipo的藥代動力學(xué)顯示血漿中mRNA殘留主要在脾臟，96 h后幾乎檢測不到，這些結(jié)果證明NeoPol-mL242無急性毒性，安全譜良好，低劑量即可誘導(dǎo)魯棒T細(xì)胞應(yīng)答而無顯著炎癥或損傷。
Figure 7. NeoPol-mL242 mRNA疫苗在小鼠中的安全性評估
此研究聚焦于脾靶向NeoPol-mL242 mRNA疫苗在肝細(xì)胞癌（HCC）模型中的應(yīng)用，通過優(yōu)化L242-20Lipo遞送系統(tǒng)實現(xiàn)了高效的脾選擇性mRNA遞送與DCs激活，顯著減少肝毒性。在黑色素瘤和HCC模型中，疫苗成功誘導(dǎo)強效T細(xì)胞應(yīng)答，有效抑制腫瘤生長并延長生存，展現(xiàn)了其在癌癥免疫療法中的突出潛力。
當(dāng)前，mRNA疫苗如BNT111在黑色素瘤中取得進展，但肝靶向限制了其在HCC中的應(yīng)用，脾靶向LNPs的創(chuàng)新結(jié)合AI預(yù)測技術(shù)有望推動療效提升與副作用降低，預(yù)示著未來免疫治療的新方向。
本研究中，關(guān)鍵的Anti-mouse MHC-Tetramer-PE (Ptpn2376-384 (RWLYWQPTL) :H-2Kb) 由AtaGenix Laboratories Co., Ltd. (Wuhan, PR China) 定制開發(fā)提供。AtaGenix 長期專注于高質(zhì)量蛋白與抗體產(chǎn)品的開發(fā)，提供從抗體發(fā)現(xiàn)、定制開發(fā)到大規(guī)模生產(chǎn)的一站式服務(wù)，助力科研工作者高效推進機制研究與靶點驗證。
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