聯系我們
一、 實驗目的
客戶通過CO-IP實驗證實A、B兩個蛋白有相互作用，想進一步通過體外實驗驗證，其中A蛋白大小為45kDa，親水性較好，選用大腸桿菌系統獲得GST-A蛋白; B蛋白疏水性很強，且非常大(275kDa)，普健根據多年蛋白制備經驗，推薦客戶選擇用昆蟲系統表達B蛋白(PS：昆蟲桿狀病毒能容納大分子的插入片段，能包裝大的基因片段)
二、 B蛋白制備流程
1、 B蛋白分析：
B蛋白一共2511AAs，無信號肽，無跨膜結構域，疏水性很強，選取1-2511AAs為表達目的片段，C端添加6*his標簽;
(1)信號肽分析結果：
(2)疏水性分析結果：
(3)跨膜區分析結果：
1、 基因優化合成B蛋白，構建pFast-bac1-B表達質粒;
2、 藍白斑篩選方法獲得重組的Bacmid，經PCR鑒定陽性后，轉染sf9細胞，獲得P1代病毒粒子，通過P1代表達測試，鑒定是否有目的蛋白表達;
3、 生產P2代病毒粒子，進行MOI測試，選最優條件進行200ml放大及純化，獲得目的蛋白;
三、 實驗結果
圖1：P1代表達測試結果
A. 考馬斯亮藍染色. B. His 標簽抗體WB鑒定蛋白 (ECL曝光).
圖2：P2代MOI測試結果
考馬斯亮藍染色
圖3：樣品純化后QC結果
A.考馬斯亮藍染色. B. His 標簽抗體WB鑒定蛋白 (ECL曝光).
實驗結果分析：
SDS-PAGE結果顯示260kDa左右有條帶，通過His 標簽，WB檢測曝出與目的蛋白大小一致的條帶，說明SDS-PAGE膠上的條帶為目的蛋白條帶，蛋白純度為90%。
蛋白表達量為：200ml可純化到1.8mg His-B蛋白
圖4：GST-A蛋白與HIS-B蛋白GST pull down實驗結果
結論：GST-A蛋白與His-B蛋白是有相互作用的。
相關服務
